Transduction lentivirale de cellules progénitrices neurales pour la régulation épigénétique de l’expression de l’alpha-synucléine

Résumé

Source : Tagliafierro, L., et al. Plateforme de vecteurs lentiviraux pour l’administration efficace d’outils d’édition d’épigénome dans des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la transduction lentivirale des cellules progénitrices neurales (NPC) pour la modification épigénétique ciblée de l’alpha-synucléine, une protéine clé de la maladie de Parkinson. Le protocole permet la méthylation de l’ADN médiée par la méthyltransférase, réduisant l’expression de la SNCA pour l’étude de la régulation des gènes et des interventions thérapeutiques potentielles.

Protocole

1. Différenciation des cellules progénitrices neurales dopaminergiques dopaminergiques

1. décongélation des NPC MD (cellules progénitrices neurales dopaminergiques du mésencéphale)
   1. Préparez une plaque revêtue de BMM (membrane matricielle basique) et réchauffez le N2B27 complet. Ajouter 10 ml de DMEM/F12 chaud dans un tube conique de 15 ml. Placez un flacon cryogénique dans un bloc thermique à 37 °C pendant 2 min.
      1. Transférez les cellules du cryoflacon dans le tube contenant DMEM/F12. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
      2. Aspirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 2 mL de N2B27 et ajoutez la suspension cellulaire dans un puits de la plaque recouverte de BMM. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂.

2. Transduction des NPC MD et analyse des changements de méthylation

1. Transduction des NPC MD
   1. Transducte des NPC MD à 70 % de confluence avec les vecteurs RNA-guide LV (vecteur lentiviral)/Cas9-DNMT3A désactivé (ADN méthyltransférase enzyme 3A) au MOI (multiplicité de l’infection) = 2. Remplacez le N2B27 medium 16h post-transduction.
   2. Ajouter N2B27 avec 5 μg/mL de puromycine, 48 h après la transduction. Cultivez les cellules pendant 3 semaines dans N2B27 plus puromycine pour obtenir les lignées NPC MD stables. Les cellules sont prêtes pour des applications en aval (analyses d’ADN, d’ARN, de protéines, caractérisation phénotypique, congélation et passage).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Equipment
15 mL tubes à centrifuger coniques	Corning	430791
6-well	Corning	3516
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Microscope à fluorescence inversée	Leica	DM IRB2
Réactifs
Solution antibiotique-antimycosique, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Supplément (50X), moins vitamine A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049

plates de culture cellulaire